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簡(jiǎn)要介紹
凝膠色譜法又叫凝膠色譜技術(shù)，是六十年代初發(fā)展起來(lái)的一種快速而又簡(jiǎn)單的分離分析技術(shù)，由于設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便，不需要有機(jī)溶劑，對(duì)高分子物質(zhì)有很高的分離效果。凝膠色譜法又稱分子排阻色譜法。凝膠色譜法主要用于高聚物的相對(duì)分子質(zhì)量分級(jí)分析以及相對(duì)分子質(zhì)量分布測(cè)試。根據(jù)分離的對(duì)象是水溶性的化合物還是有機(jī)溶劑可溶物，又可分為凝膠過濾色譜（GFC）和凝膠滲透色譜（GPC）。 GFC一般用于分離水溶性的大分子，如多糖類化合物。凝膠的代表是葡萄糖系列，洗脫溶劑主要是水。凝膠滲透色譜法主要用于有 機(jī)溶劑中可溶的高聚物（聚苯乙烯、聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等）相對(duì)分子質(zhì)量分布分析及分離，常用的凝膠為交聯(lián)聚苯乙烯凝膠，洗脫溶劑為*等有機(jī)溶劑。凝膠色譜不但可以用于分離測(cè)定高聚物的相對(duì)分子質(zhì)量和相對(duì)分子質(zhì)量分布，同時(shí)根據(jù)所用凝膠填料不同，可分離油溶性和水溶 性物質(zhì)，分離相對(duì)分子質(zhì)量的范圍從幾百萬(wàn)到100以下。近年來(lái)，凝膠色譜也廣泛用于分離小分子化合物。化學(xué)結(jié)構(gòu)不同但相對(duì)分子質(zhì)量相近的物質(zhì)，不可能通過凝膠色譜法達(dá)到*的分離純化的目的。凝膠色譜主要用于高聚物的相對(duì)分子質(zhì)量分級(jí)分析以及相對(duì)勿子質(zhì)量分布測(cè)試。目前已經(jīng)被生物化學(xué)、分子生物學(xué)、生物工程學(xué)、分子免疫學(xué)以及醫(yī)學(xué)等有關(guān)領(lǐng)域廣泛采用，不但應(yīng)用于科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，而且已經(jīng)大規(guī)模地用于工業(yè)生產(chǎn)。
1基本理論
分子篩效益
兩種全排阻的分子即使大小不同，也不能有分離效果。直徑比凝膠小孔直徑小的分子能進(jìn)入凝膠的全部孔隙。如果兩種分子都能全部進(jìn)入凝膠孔隙，即使它們的大小有差別，也不會(huì)有好的分離效果。因此，一定的分子篩有它一定的使用范圍。綜上所述，在凝膠色譜中會(huì)有三種情況，一是分子很小，能進(jìn)入分子篩全部的內(nèi)孔隙；二是分子很大，*不能進(jìn)入凝膠的任何內(nèi)孔隙；三是分子大小適中，能進(jìn)入凝膠的內(nèi)孔隙中孔徑大小相應(yīng)的部分。大、中、小三類分子彼此間較易分開，但每種凝膠分離范圍之外的分子，在不改變凝膠種類的情況下是很難分離的。對(duì)于分子大小不同，但同屬于凝膠分離范圍內(nèi)各種分子，在凝膠床中的分布情況是不同的：分子較大的只能進(jìn)入孔徑較大的那一部分凝膠孔隙內(nèi)，而分子較小的可進(jìn)入較多的凝膠顆粒內(nèi)，這樣分子較大的在凝膠床內(nèi)移動(dòng)距離較短，分子較小的移動(dòng)距離較長(zhǎng)。于是分子較大的先通過凝膠床而分子較小的后通過凝膠床，這樣就利用分子篩可將分子量不同的物質(zhì)分離。另外，凝膠本身具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大的分子在通過這種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上的孔隙時(shí)阻力較大，小分子通過時(shí)阻力較小。分子量大小不同的多種成份在通過凝膠床時(shí)，按照分子量大小“排隊(duì)，凝膠表現(xiàn)分子篩效應(yīng)。
重要參數(shù)
⑴柱體積：柱體積是指凝膠裝柱后，從柱的底板到凝膠沉積表面的體積。在色譜柱中充滿凝膠的部分稱為凝膠床，因引柱體積又稱“床”體積，常用Vt 表示。
⑵外水體積：色譜柱內(nèi)凝膠顆粒間隙，這部分體積稱外水體積，亦稱間隙體積，常用Vo表示。
⑶內(nèi)水體積：因?yàn)?/span>凝膠為三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，顆粒內(nèi)部仍有空間，液體可進(jìn)入顆粒內(nèi)部，這就分間隙的總和為內(nèi)水體積，又稱定相體積，常用Vi表示。 不包括固體支持物的體積（Vg）。
⑷峰洗脫體積：是指被分離物質(zhì)通過凝膠柱所需洗脫液有體積，常用Ve 表示。當(dāng)使用樣品的體積很少時(shí)，（與洗脫體積比較可以忽略不計(jì)），在洗脫圖中，從加樣到峰頂位置所用洗脫液體積為Ve。 當(dāng)樣品體積與洗脫體積比較不能忽略時(shí)，洗脫體積計(jì)算可以從樣品體積的一半到峰頂位置。當(dāng)樣品很大時(shí)，洗脫體積計(jì)算可以從應(yīng)用樣品開始到洗脫峰升高的彎曲點(diǎn)（或半高處）。
2填料合成
凝膠色譜填料合成技術(shù)的進(jìn)展主要在下面四個(gè)方面：填料的微球化、窄粒度分布多孔硅微球的合成成功、小孔徑多孔硅微球合成成功以及新的硅微球表面化學(xué)改性的發(fā)展。近年來(lái)在這方面有較多的新產(chǎn)品，中國(guó)也有許多單位在研制和生產(chǎn)。凝膠色譜正在迅速改變凝膠色譜的應(yīng)用面。
色譜柱除了對(duì)填料的粒度有要求外，對(duì)粒度分布也要求相當(dāng)窄。用一般的制備方法往往得到粒度較寬的產(chǎn)品，需要進(jìn)一步過篩。當(dāng)填料的粒度在30微米以下時(shí)，這種過篩非常困難，已經(jīng)成為填料制備上一個(gè)較大的技術(shù)難關(guān)。Kirkland，近利用了尿素和甲醛在酸性介質(zhì)中形成大小均勻的液體高聚物，加入某種硅溶膠時(shí)，硅溶膠的微珠將在液體高聚物中凝聚。后把有機(jī)高聚物灼燒掉后就能得到由微粒硅珠堆積而成的多孔填料。這種堆積硅珠是球形的，粒度分布很窄，填料的孔徑?jīng)Q定于原始硅溶膠的規(guī)格，用不同的硅膠就可以制得不同孔徑的填料。柴志寬等則利用一種硅膠制成粒度分布窄的填料后，再利用適當(dāng)?shù)臄U(kuò)孔方法以得到各種孔徑的填料。從這些方法制得的微球填料，粒度分布可以達(dá)到相當(dāng)窄，所以可以不經(jīng)篩選直接使用。
隨著進(jìn)樣技術(shù)和色譜柱接頭設(shè)計(jì)的改進(jìn)，現(xiàn)在已經(jīng)可以得到柱效每米在八萬(wàn)到十萬(wàn)的凝膠色譜填料。Wheals用四種GPC用的微球硅膠裝填色譜柱，都能達(dá)到每米八萬(wàn)到十萬(wàn)塊塔板數(shù)的。他用這種色譜柱有效地進(jìn)行了案件偵查中所要求的分析問題。
3兩大分類
根據(jù)分離的對(duì)象是水溶性的化合物還是有機(jī)溶劑可溶物，又可分為凝膠過濾色譜（GFC）和凝膠滲透色譜（GPC）。
凝膠過濾色譜
凝膠過濾色譜一般用于分離水溶性的大分子，如多糖類化合物。凝膠的代表是葡萄糖系列，洗脫溶劑主要是水。
凝膠滲透色譜
凝膠滲透色譜法主要用于有機(jī)溶劑中可溶的高聚物 （聚苯乙烯、聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等） 相對(duì)分子質(zhì)量分布分析及分離，常用的凝膠為交聯(lián)聚苯乙烯凝膠，洗脫溶劑為*等有機(jī)溶劑。
凝膠色譜不但可以用于分離測(cè)定高聚物的相對(duì)分子質(zhì)量和相對(duì)分子質(zhì)量分布，同時(shí)根據(jù)所用凝膠填料不同，可分離油溶性和水溶性物質(zhì)，分離相對(duì)分子質(zhì)量的范圍從幾百萬(wàn)到100以下。
近年來(lái)，凝膠色譜也廣泛用于分離小分子化合物?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)不同但相對(duì)分子質(zhì)量相近的物質(zhì)，不可能通過凝膠色譜法達(dá)到*的分離純化的目的。
4凝膠種類及性質(zhì)
聚丙烯酰胺凝膠
是一種人工合成凝膠，是以丙烯酰胺為單位， 由甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)成的，經(jīng)干燥粉碎或加工成形制成粒狀，控制交聯(lián)劑的用量可制成各種型號(hào)的凝膠。交聯(lián)劑越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝膠的商品為生物膠－P （Bio-Gel P），由日本tosoh的TSKGEL的pw系列，適合蛋白和多糖的純化。
交聯(lián)葡聚糖凝膠
⑴Sephadex G交聯(lián)葡聚糖的商品名為Sephadex，不同規(guī)格型號(hào)的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯?dāng)?shù)為凝膠得水值的10倍。例如，G-25為每克凝膠膨脹時(shí)吸水2.5克，同樣G-200克每克干膠吸水20克。交聯(lián)葡聚糖凝膠的種類有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。因此，“G”反映，凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分部范圍。
⑵Sephadex LH-20，是─Sephadex G-25的羧丙基衍生物， 能溶于水及親脂溶劑，用于分離不溶于水的物質(zhì)。
瓊脂糖凝膠
商品名很多，常見的有，Sepharose（瑞典，pharmacia ），Bio-Gel-A（美國(guó)Bio-Rad）等。瓊脂糖凝膠是依靠糖鏈之間的次級(jí)鏈如氫鍵來(lái)維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的疏密依靠瓊脂糖的濃度。一般情況下，它的結(jié)構(gòu)是穩(wěn)定的，可以在許多條件下使用（如水，pH4-9范圍內(nèi)的鹽溶液）。瓊脂糖凝膠在40℃以上開始融化，也不能高壓消毒，可用化學(xué)滅菌活處理。
聚苯乙烯凝膠
商品為Styrogel， 具有大網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)， 可用于分離分子量1600到40，000，000的生物大分子，適用于有機(jī)多聚物，分子量測(cè)定和脂溶性天然物的分級(jí)，凝膠機(jī)械強(qiáng)度好，洗脫劑可用甲基亞砜。
5實(shí)驗(yàn)技術(shù)
層析柱
層析柱是凝膠層析技術(shù)中的主體，一般用玻璃管或有機(jī)玻璃管。層析柱的直徑大小不影響分離度，樣品用量大，可加大柱的直徑，一般制備用凝膠柱，直徑大于2厘米，但在加樣時(shí)應(yīng)將樣品均勻分布于凝膠柱床面上。此外， 直徑加大，洗脫液體體積增大，樣品稀釋度大。分離度取決于柱高，為分離不同組分，凝膠柱床必須有適宜的高度，分離度與柱高的平方根相關(guān)，但由于軟凝膠柱過高擠壓變形阻塞，一般不超過1米。分族分離時(shí)用短柱，一般凝膠柱長(zhǎng)20-30厘米，柱高與直徑的比較5:1─10:1，凝膠床體積為樣品溶液體積的4-10倍。 分級(jí)分離時(shí)柱高與直徑之線為20:1─100:1，常用凝膠柱有50×25厘米，10×25厘米。層析柱濾板下的死體積應(yīng)盡可能的小，如果支掌濾板下的死體積大，被分離組分之間重新混合的可能性就大，其結(jié)果是影響洗脫峰形，出現(xiàn)拖尾出象，降低分辯力。在分離時(shí)，死體積不能超過總床體積的1/1000。
凝膠的選擇
根據(jù)所需凝膠體積，估計(jì)所需干膠的量。 一般葡聚糖凝膠吸水后的凝膠體積約為其吸水量的2倍，例如Sephadex G-20的吸水量為20，1 克Sephadex G─200吸水后形成的凝膠體積約40ml。凝膠的粒度也可影響層析分離效果。粒度細(xì)胞分離效果好，但阻力大，流速慢。一般實(shí)驗(yàn)室分離蛋白質(zhì)采用100-200號(hào)篩目的的Sephadex G-200效果好， 脫鹽用Sephadex G-25、G-50，用粗粒，短柱，流速快。
凝膠的制備
凝膠色譜法相關(guān)儀器
商品凝膠是干燥的顆粒使用前需直接在欲使用的洗脫液中膨脹。為了加速膨脹，可用加熱法，即在沸水浴中將濕凝膠逐漸升溫至近沸，這樣可大大中速膨脹，通常在1-2小時(shí)內(nèi)即可完成。特別是在使用軟膠時(shí)， 自然膨脹需24小時(shí)至數(shù)天，而用加熱法在幾小時(shí)內(nèi)就可完成。這種方法不但節(jié)約時(shí)間，而且還可消毒，除去凝膠中污染的細(xì)菌和排除膠內(nèi)的空氣。
樣品溶液處理
樣品溶液如有沉淀應(yīng)過濾或離心除去，如含脂類可高速離心或通過Sephadex G-15短柱除去。樣品的粘度不可大，含蛋白為超過4%，粘度高影響分離效果。上柱樣品液的體積根據(jù)凝膠床體積的分離要求確定。分離蛋白質(zhì)樣品的體積為凝膠床的1-4%（一般約0.5-2ml），進(jìn)行分族分離時(shí)樣品液可為凝膠床的10%，在蛋白質(zhì)溶液除鹽時(shí)，樣品可達(dá)凝膠床的20-30%。 分級(jí)分離樣品體積要小，使樣品層盡可能窄，洗脫出的峰形較好。
防止微生物污染
交聯(lián)葡聚糖和瓊脂糖都是多糖類物質(zhì)，防止微生物的生長(zhǎng)，在凝膠層析中十分重要，常用的抑菌劑有:
⑴疊氨鈉（NaN3）
在凝膠層析中只要用0.02%疊氮鈉已足夠防止微生物的生長(zhǎng)，疊氮鈉易溶一水，在20℃時(shí)約為40%；它不與蛋白質(zhì)或碳水化合物相互作用，因此疊氮鈉不影響抗體活力；不會(huì)改變蛋白質(zhì)和碳水化合物的層析我特性。疊氮鈉可干擾熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)。
⑵可樂酮[Cl3C-C（OH）（CH3）2]
在凝膠層析中使用濃度為0.01-0.02%。在微酸性溶液中它的殺菌效果佳，在強(qiáng)堿性溶液中或溫度高于60℃時(shí)易引起分解而失效。
⑶乙基汞代巰基水楊酸鈉
在凝膠層析中作為抑菌劑使用濃度為0.05-0. 01%。在微酸性溶液中為有效。重金屬離子可使乙基代巰基的物質(zhì)結(jié)合，因而包含疏基的蛋白質(zhì)可在不同程度上降低它的抑菌效果。
⑷苯基汞代鹽
在凝膠層析中使用濃度為0.001-0.01%。在微堿性溶液中抑效果佳，長(zhǎng)時(shí)間放置時(shí)可與鹵素、硝酸根離子作用而產(chǎn)生沉淀；還原劑可引起此化合物分解；含疏基的物質(zhì)亦可降低或抑制它的抑菌作用。
6研究動(dòng)向
凝膠色譜的大量研究工作仍是多方面的，其中儀器、填料、聯(lián)用技術(shù)、色譜理論等方面的進(jìn)展是和整個(gè)液體色譜的進(jìn)展相關(guān)的。但是下面四個(gè)研究動(dòng)向意義較大，值得注意。
通過與其他儀器聯(lián)用，解決凝膠色譜法測(cè)定高聚物分子量分布從相對(duì)法向法過渡。測(cè)定高聚物分子量分布是凝膠色譜重要的應(yīng)用。試樣先根據(jù)分子體積（即分子量）分離后再檢測(cè)各組分的分子量及含量。在凝膠色譜中試樣的分離是在色譜柱中進(jìn)行的，被分離后的組分在流出柱子時(shí)就同時(shí)連續(xù)地用濃度檢測(cè)器和分子量檢測(cè)器分別檢側(cè)各組分的濃度和分子量，把兩個(gè)檢測(cè)器的輸出訊號(hào)用記錄儀記錄后即得反映分子量分布的凝膠色譜曲線。過去由于沒有比較靈敏和瞬時(shí)響應(yīng)的分子量檢測(cè)器，因而利用一組不同分子量的標(biāo)樣來(lái)標(biāo)定色譜柱，然后從分子量淋出休積的標(biāo)定曲線來(lái)作數(shù)據(jù)換算。這種用相對(duì)方法來(lái)檢測(cè)分子量雖然暫時(shí)解決了問題，但是隨之而來(lái)的是實(shí)驗(yàn)工作量增加以及數(shù)據(jù)處理方法上存在困難。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性在很大程度上決定于標(biāo)定曲線、標(biāo)樣分子量數(shù)值以及數(shù)據(jù)處理方法的可靠性。其中色譜柱分離效率不理想所引起的色譜峰加寬效應(yīng)的改正，不但實(shí)驗(yàn)方法比較煩瑣，而且數(shù)據(jù)處理也比較復(fù)雜，需要用電子計(jì)算機(jī)來(lái)計(jì)算。所以雖然文獻(xiàn)中已經(jīng)推薦許多據(jù)說(shuō)是比較滿意的計(jì)算方法，但這總不是一個(gè)根本解決的方法。只有真正找到分子量檢測(cè)器，問題才算較好解決。原有的許多分子量測(cè)定方法，由于不能做到足夠靈敏的瞬時(shí)響應(yīng)而未能成功地在凝膠色譜上應(yīng)用。
近Ouano用激光小角光散射儀（LALLS）來(lái)作分子量檢測(cè)器得到比較好的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不需要標(biāo)定曲線，也不必進(jìn)行峰加寬改正。
由于激光的準(zhǔn)直性較好，強(qiáng)度較大，可以允許在較小的角度下測(cè)量較稀溶液的散射光強(qiáng)，由此可以直接計(jì)算出重均分子量的近似值而不需要象經(jīng)典光散射那樣實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)還要對(duì)濃度和散射角度向零作雙外推。實(shí)驗(yàn)上，凝膠色譜儀和激光小角光散射儀聯(lián)用后，還可與計(jì)算機(jī)直接聯(lián)接進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。在一次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行完畢后，所需要的數(shù)據(jù)可全部立即取得。GPC-LALLS似乎得到更合理的數(shù)值。激光小角散射儀已開始商品化，預(yù)計(jì)不久將會(huì)有更多的研究工作，來(lái)說(shuō)明已經(jīng)在何種程度上解決了凝膠色譜的相對(duì)測(cè)定過渡到測(cè)定。
凝膠色譜中的濃度檢測(cè)器和通常的液體色譜一樣仍然是一個(gè)薄弱環(huán)節(jié)，繼續(xù)在尋找更理想的檢測(cè)器。目前常用的仍然是示差折光檢測(cè)器和紫外檢測(cè)器。
近Hoffmann和Urban用自動(dòng)濁度滴定裝置來(lái)作濃度檢測(cè)器也收到一定效果，特別對(duì)二元共聚中測(cè)定分子量分布和組成分布，效果比較顯著。Jorgenson等用光散射法側(cè)定淋出溶質(zhì)的沉淀，也證明是一個(gè)較靈敏的方法。Francois等用密度計(jì)來(lái)檢側(cè)濃度，提供了另一條通用性檢測(cè)器的途徑。其他如質(zhì)譜和原子吸收光譜也都能與凝膠色譜聯(lián)用。隨著應(yīng)用的擴(kuò)大，凝膠色譜可以用于測(cè)定高聚物長(zhǎng)支鏈的支化度。
參考資料
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